Kloning DNA adalah teknik penting di laboratorium biologi molekuler.Enzim restriksi dan polymerase chain reaction (PCR) digunakan untuk mendapatkan segmen DNA tertentu.Segmen DNA ini kemudian “dipotong dan ditempelkan” menjadi vektor plasmid.Plasmid adalah DNA yang mereplikasi secara independen dari DNA kromosom sel mereka ditemukan dalam sel bakteri, meskipun beberapa sel hewan mungkin mengandung plasmid.
Segmen pendek DNA digabungkan dengan DNA vektor plasmid menggunakan enzim yang disebut DNA Ligase.Vektor plasmid mengandung tiga komponen: asal replikasi (ori), gen resistensi antibiotik, dan sisi kloning (yang berisi gen yang akan diklon).Plasmid memiliki sekitar 3.000-12.000 pasangan basa, dan dimasukkan ke dalam sel bakteri menggunakan proses yang disebut transformasi bakteri.
Kloning DNA dalam vektor plasmid adalah proses yang mudah: DNA ditempatkan dalam plasmid, lalu ke dalam sel bakteri. Bakteri ditanam dalam media yang dicampur dengan antibiotik untuk memilih sel rekombinan. Lisis sel menghilangkan DNA seluler.
Bakteri yang mengandung DNA hasil kloning kemudian melalui proses penyaringan sel: sel-sel tersebut dilapisi pada agar-agar yang dilapisi antibiotik.Bakteri yang mengandung plasmid rekombinan akan dapat tumbuh pada plate ini, karena plasmid mengandung gen resistensi antibiotik, sedangkan sel bakteri yang tidak mengambil vektor rekombinan akan mati.Bakteri yang mengandung vektor akan tumbuh dan membelah, mereplikasi gen yang diinginkan.
Sel bakteri kemudian dipecah (proses yang disebut lisis) dan DNA dimurnikan dari protein.Plasmid cukup mudah diisolasi dari DNA kromosom karena lebih kecil – proses yang disebut fraksinasi digunakan untuk mengumpulkan plasmid.
Tinjauan Teknik Biologi Molekuler
Kloning Vektor: Bagian dari DNA dimasukkan ke dalam plasmid.Pertumbuhan dan pembelahan sel bakteri menciptakan banyak salinan dari urutan DNA yang diinginkan.
PCR: Polymerase Chain Reaction memungkinkan replikasi dan amplifikasi urutan DNA tertentu.
Elektroforesis gel dan SDS PAGE memisahkan DNA atau protein menjadi pita khusus ukuran untuk memungkinkan identifikasi.
Blotting : Memungkinkan deteksi dan identifikasi DNA, protein, atau RNA.
Microarray memungkinkan deteksi beberapa area genom dalam satu tes.
HPLC dan Kromatografi memurnikan protein.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Primer DNA (yang memiliki sekuens pelengkap) digunakan, bersama dengan DNA Polymerase.Jika urutan yang diinginkan adalah ACTGACTG, misalnya, maka primernya adalah TGACTGAC.DNA polimerase yang digunakan untuk PCR biasanya Taq polimerase. DNA polimerase dengan stabilitas pada suhu tinggi (kinerja optimumnya pada 75-80 ° C).
Sejumlah volume kecil dari buffer yang mengandung DNA ditambahkan ke tabung di dalam thermal cycler.Larutanyaa dipanaskan hingga kira-kira 95 ° C, di mana ia ditahan selama beberapa menit.DNA kemudian didenaturasi pada suhu tinggi (94-98 ° C): ini menyebabkan untaian terpisah, menciptakan DNA untai tunggal.Mendenaturasi DNA hanya membutuhkan beberapa detik: langkah ini biasanya membutuhkan sekitar 30 detik.
DNA kemudian “ditempelkan”, yang memungkinkan primer terhubung dengan untaian tunggal DNA.Suhu larutan diturunkan menjadi sekitar 55 ° C.Polimerase mengikat hibrida templat-primer dan mulai membentuk DNA.
Suhu kemudian dinaikkan hingga kira-kira 75 ° C (tergantung pada polimerase yang digunakan), dan polimerase bekerja, menciptakan untaian DNA yang melengkapi cetakan.Ini berlanjut, dengan setiap ekstensi menghasilkan jumlah untai DNA dua kali lipat.Hal ini menyebabkan peningkatan eksponensial dalam jumlah DNA.Pada akhir proses amplifikasi, larutan ditahan pada suhu 72 ° C selama sekitar 10 menit untuk memastikan bahwa semua DNA untai tunggal memanjang.
Pada akhir reaksi PCR, larutan didinginkan hingga suhu 4-8 ° C dan disimpan.Elektroforesis gel umumnya dijalankan untuk memastikan urutan DNA yang benar telah diperkuat.
RT-PCR memungkinkan amplifikasi dan kuantifikasi DNA terjadi pada waktu yang bersamaan.Reaksi berantai polimerase secara real time mendeteksi jumlah DNA secara real time, saat reaksi berantai terjadi.Metode ini juga digunakan untuk mendeteksi mRNA: reverse-transcriptase dikombinasikan dengan reaksi RT-PCR dan jumlah mRNA dapat ditentukan.Laporan penyelidikan umumnya merupakan DNA untai ganda yang digabungkan dengan penanda fluoresen.Fluoresensi diukur dan dikuantifikasi selama reaksi.RT-PCR lebih akurat daripada Southern atau Northern Blotting.Cara ini sering digunakan untuk mendiagnosis kelainan genetik atau kanker.RT-PCR juga digunakan di laboratorium penelitian untuk mendeteksi perubahan ekspresi gen misalnya, mengukur efek obat pada urutan genetik tertentu.
Elektroforesis Gel
Asam nukleat (DNA dan RNA) dapat dipisahkan berdasarkan ukurannya menggunakan teknik yang disebut elektroforesis gel.Asam nukleat ditempatkan ke dalam lubang dalam gel agarosa.Arus listrik diberikan dan DNA / RNA bermigrasi ke kutub positif.Molekul dipisahkan menurut panjangnya, karena molekul yang lebih pendek dari asam nukleat bergerak lebih cepat melalui pori-pori gel.Sampel kontrol dengan panjang nukleotida yang diketahui (disebut DNA Penanda) digunakan untuk menyimpulkan ukuran pita.Setelah gel yang digunakan untuk elektroforesis dibuat dengan etidium bromida, yang membuat pita DNA terlihat di bawah sinar ultraviolet.Karena etidium bromida tidak terlihat dalam cahaya alami, loading buffer/dye yang mengandung bromofenol biru biasanya digunakan saat menginjeksikan sampel ke dalam lubang.Buffer ini akan bergerak dengan kecepatan yang sama dengan DNA, memberikan indikasi visual kemajuan saat asam nukleat bergerak melalui gel.Sampel yang diketahui digunakan untuk menyimpulkan panjang pita.
Gel agarosa, menunjukkan pita DNA setelah PCR. Pita di sebelah kiri adalah DNA penanda, digunakan untuk menentukan ukuran pita yang dibuat oleh sampel PCR
Elektroforesis SDS PAGE 2D:
Mirip dengan metode elektroforesis gel yang digunakan untuk asam nukleat, protein dapat dipisahkan melalui elektroforesis.Karena molekul protein umumnya terlalu kecil untuk disaring oleh pori-pori gel yang lebih besar, molekul protein dipisahkan oleh muatan.Teknik lain yang disebut SDS-PAGE digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan panjangnya.Gel poliakrilamida (PAGE) memiliki ukuran pori yang seragam dan dapat memisahkan protein dari 5-2.000 kDa (kilo dalton).Protein biasanya diwarnai dengan pewarna Coomassie Brilliant Blue
Teknik Hibridisasi Molekuler
Southern Blot
Southern Blot adalah cara untuk melihat urutan DNA tertentu yang dipisahkan oleh elektroforesis gel.Untuk memverifikasi bahwa gen tertentu telah diperoleh melalui PCR atau kloning vektor, DNA yang dipisahkan ditempatkan pada filter, dihibridisasi dengan urutan probe, dan divisualisasikan.Dinamai untuk ahli biologi Edwin Southern, tes ini melibatkan penempatan gel-elektroforesis dipisahkan DNA untai tunggal (ssDNA) ke filter. DNAProbe hibridisasi didenaturasi menjadi untai tunggal, lalu ditambahkan ke filter.Probe menempel pada urutan target ssDNA.Probe berisi penanda radioaktif atau fluoresen – filter dapat dilihat dengan mengambil film sinar-X (untuk penanda radioaktif) atau di bawah sinar UV (penanda fluoresen).
Northern Blot
Karena tes pertama untuk mempelajari ekspresi gen disebut Southern Blot setelah Edwin Southern, semua tes lain dalam kategori umum yang sama diberi nama dengan cara yang sesuai.Northern Blot mendeteksi RNA dalam sampel daripada DNA.RNA dipisahkan melalui elektroforesis gel, kemudian ditempatkan pada membran Nilon dengan sistem pengelupasan kapiler.Panas digunakan untuk menghubungkan RNA ke membran, kemudian probe berlabel dihibridisasi ke RNA yang diimobilisasi pada membran.RNA kemudian divisualisasikan menggunakan sinar-X.
Western Blot
Menggunakan teknik yang mirip dengan metode yang disebutkan di atas, Western Blot digunakan untuk mendeteksi protein daripada urutan DNA atau RNA.Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan protein, yang kemudian ditransfer ke nitroselulosa.Membran nitroselulosa kemudian “diblok” dengan larutan yang mengandung albumin serum sapi (BSA) dan sedikit Tween 20 (deterjen).Pemblokiran mencegah protein lain yang tidak diinginkan mengikat ke membran.Probe yang mengandung antibodi ke protein ditambahkan antibodi mengikat protein target.Antibodi sekunder kemudian digunakan: antibodi sekunder dihubungkan dengan enzim yang bereaksi terhadap warna seperti peroksidase lobak (HRP) dan ditargetkan untuk melawan antibodi pertama.Ketika antibodi sekunder berikatan dengan antibodi primer, reaksi yang terlihat terjadi.Kedalaman warna menentukan seberapa banyak protein yang terikat: spektrofotometer digunakan untuk mengukur secara objektif intensitas reaksi kolorimetri.
Eastern Blot
Perpanjangan Western Blot, teknik ini mendeteksi modifikasi pasca translasi (PTM).Ketika mRNA menerjemahkan protein, mereka biasanya menjalani PTM sebelum berfungsi.Molekul protein dapat diglikosilasi, disulfasi, atau dimodifikasi dengan berbagai cara.Eastern Blot mendeteksi modifikasi pasca-translasi yang terjadi pada protein setelah diterjemahkan dari mRNA.Protein dipisahkan melalui SDS-PAGE dan ditempelkan ke mebran nitroselulosa.Probe khusus untuk jenis modifikasinya kemudian ditambahkan: jika seorang peneliti ingin melihat modifikasi fosforilasi pada protein, misalnya, dia akan menggunakan probe khusus untuk fosforilasi.
Lectin Blotting
Mirip dengan Eastern Blotting, Lectin Blotting menyelidiki modifikasi karbohidrat menjadi protein dan lemak.
Array
Mikroarray DNAMikroarray DNA mampu mendeteksi banyak wilayah genom dengan satu tes.Probe DNA melekat pada permukaan padat, menargetkan urutan genetik tertentu.Permukaan padat dapat berupa chip silikon, kaca, atau manik-manik mikroskopis.Sampel ditambahkan ke pelat dan urutan yang cocok dengan probe yang dipasang dan diikat ke probe.Chip tersebut kemudian dicuci untuk menghilangkan DNA yang tidak terikat.DNA diberi label dengan target chemiluminescent, dan lempengan itu dibaca.Kedalaman perkembangan warna sesuai dengan kuantitas DNA yang terikat.
Protein mikroarray
Array pengikat protein digunakan untuk mengidentifikasi interaksi protein, aktivasi protein, dan kuantifikasi protein dalam sampel pasien.Array ini menggunakan kaca atau silikon sebagai permukaan padat, dan biasanya menggunakan antibodi monoklonal untuk menangkap protein target.Beberapa mikroarray protein menggunakan DNA untai ganda yang secara khusus ditargetkan ke protein sebagai mekanisme penangkapan.Jumlah protein dihitung dengan menggunakan chemiluminescence, dan reaksi kolorimetri diukur pada pemindai microarray.
Array Oligonukleotida:
Susunan ini benar-benar miniatur DNA mikroarray, tes ini terdiri dari puluhan ribu nukleotida sintetis pada permukaan padat.Uji kepadatan tinggi ini sering digunakan untuk penyaringan genetik: susunan oligonukleotida Affymetrix, misalnya, mampu menyusun lebih dari 300.000 nukleotida dalam waktu kurang dari satu inci persegi.Array oligonukleotida digunakan untuk genotipe, menentukan ekspresi gen, memetakan perpustakaan genom, dan penelitian penyakit.
Chip Gen Affymetrix – microarray ini digunakan untuk memeriksa beberapa urutan genetik dari genom manusia. Jenis chip ini dapat digunakan untuk skrining genetik untuk anak dengan cacat lahir bawaan.
Pemurnian Protein dan Peptida
Ada beberapa metode untuk memurnikan protein di laboratorium mikrobiologi.Setelah dimurnikan, protein dipekatkan dengan pengeringan beku (liofilisasi) atau dengan menggunakan ultrafiltrasi, yang memusatkan protein pada membran.Metode untuk memurnikan protein meliputi:
HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi adalah teknik umum yang digunakan di laboratorium biologi molekuler dan biokimia.Tekanan tinggi mendorong molekul protein naik ke bahan kolom hidrofobik.Protein kemudian dielusi dari kolom menggunakan pelarut, dan fraksi protein yang diinginkan dikumpulkan.Protein yang dimurnikan kemudian dapat dibekukan untuk penyimpanan jangka panjang.HPLC tidak digunakan untuk protein yang tidak memiliki kemampuan untuk melipat kembali, tekanan tinggi umumnya menyebabkan protein berubah sifat.
Kromatografi Afinitas
Resin yang dilapisi dengan ligan khusus untuk protein yang diinginkan ditempatkan dalam sebuah kolom.Protein mengikat ligan (yang seringkali berupa lektin) dan protein yang tidak terikat akan hanyut.Larutan yang mengandung kadar gula tinggi kemudian ditambahkan untuk melepaskan protein terikat yang diinginkan: gula bersaing dengan protein untuk tempat pengikatan lektin.Dalam beberapa kasus, lektin harus didenaturasi untuk melepaskan protein terikat.Protein yang dimurnikan dikumpulkan dan disimpan.
Kromatografi Imunoafinitas
Antibodi khusus untuk protein yang diinginkan dilapisi ke bahan kolom.Larutan sampel dimasukkan ke kolom, dan protein yang ditargetkan mengikat antibodi.Protein yang tidak terikat dicuci, dan protein yang diinginkan kemudian dielusi dengan mengubah salinitas atau pH kolom.
