by

Prosedur Langkah demi Langkah Protokol PCR

Reaksi rantai polimerase, atau PCR, pada awalnya dikembangkan oleh Kary Mullis, yang memenangkan Hadiah Nobel untuk ini pada tahun 1993.

PCR adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk menghasilkan sejumlah besar DNA tertentu. Reaksi rantai polimerase menghasilkan amplifikasi selektif dari tipe tertentu dari fragmen DNA untuk kloning.

Reaksi rantai polimerase adalah teknik amplifikasi bebas sel, yang digunakan untuk mensintesis beberapa salinan identik dari setiap DNA yang diinginkan.

Prinsip PCR

DNA yang menarik didenaturasi oleh aksi restriksi endonuklease, yang memisahkan dua untai DNA. Untai tersebut digabungkan dengan primer yang disebut renaturasi. Kompleks dupleks yang dihasilkan digunakan lebih lanjut untuk sintesis DNA.

Tiga langkah denaturasi, renaturasi, dan sintesis berlangsung berulang-ulang untuk menghasilkan salinan DNA target.

Teknik PCR dari reaksi berantai polimerase

Berikut ini adalah persyaratan penting untuk prosedur PCR seperti
Reagen:
1. DNA target.
2. Dua primer (oligonukleotida sintetik dari 17-30 nukleotida yang saling melengkapi dengan DNA)
3. 4-deoksiribonukleotida (d-ATP, d-TTP, d-GTP, d-CTP)
4. DNA polimerase yang dapat menahan suhu hingga 95 derajat Celcius.
5. Enzim Pembalikkan  transcriptase
6. 30 siklus PCR dilakukan untuk mendapatkan sampel DNA yang diinginkan.
 
Peralatan
1. Mesin PCR
2. Plat PCR
Mekanisme Kerja Pada PCR:
Mekanisme PCR yang sebenarnya melibatkan langkah-langkah berikut, yang meliputi siklus berulang dari amplifikasi DNA target.
 
1. Denaturasi :
Langkah ini juga disebut sebagai peleburan DNA target. Pada langkah ini, DNA yang penting dikenakan kisaran suhu tinggi dari 94 hingga 96 derajat Celcius, menghasilkan pemisahan dua untai DNA. Setiap untai DNA target kemudian bertindak sebagai templat untuk sintesis DNA.
 
2. Renaturasi atau annealing
Karena suhu campuran di atas secara perlahan didinginkan hingga sekitar 55 derajat Celcius, basa primer berpasangan dengan daerah komplementer yang mengapit untai target DNA. Dua oligonukleotida primer annealing atau hibridisasi untuk masing-masing DNA untai tunggal. Langkah ini beroperasi pada kisaran suhu rendah 40 hingga 60 derajat Celcius, tergantung pada panjang dan urutan primer. Proses ini disebut annealing atau renaturasi. Primer konsentrasi tinggi memastikan annealing antara setiap untai DNA dan primer daripada dua untai DNA
 
3. Sintesis atau perpanjangan rantai polimer

Awal langkah sintesis terjadi pada bagian 3-hidroksil dari masing-masing primer. Primer memanjang dengan penambahan band komplementer. Proses sintesis dalam PCR cukup sebanding dengan replikasi DNA untai utama.

Langkah terakhir adalah perpanjangan, di mana Taq DNA polimerase (bakteri termofilik Thermes aquatics) mensintesis wilayah DNA antara, menggunakan dNTPs (deoxynucleotides triphosphate) dan ion magnesium. Suhu maksimum untuk langkah ini adalah 72 derajat Celcius.
 
Semua langkah diulangi berulang-ulang untuk memberikan banyak salinan DNA target.

Aplikasinya PCR digunakan di banyak bidang sebagai berikut:
1.PCR dalam diagnosis klinis.
2.Dalam diagnosis prenatal penyakit bawaan.
3.Diagnosis penyakit retroviral.
4.Diagnosis penyakit bakteri.
5.Dalam penentuan jenis kelamin embrio.
6.Dalam sekuensing DNA.
7.Dalam studi perbandingan genom.

Sumber :

https://www.studyread.com

https://www.britannica.com

Comment

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.