3 Jenis dan Prinsip Utama dari Elektroforesis
Elektroforesis adalah salah satu teknik yang banyak digunakan dalam biokimia molekuler, mikrobiologi, penelitian biomedis. Ini adalah jenis metode pemisahan protein yang bergantung pada ukuran protein untuk memisahkan campuran.
Elektroforesis adalah salah satu teknik analisis yang sangat efektif dan metode tunggal untuk pemisahan protein untuk western blot, studi RNA, dll. Tetapi, di sisi negatif itu juga prosedur yang memakan waktu, mahal dan keterampilan teknis yang kurang disukai dalam perawatan kesehatan.
Elektroforesis adalah teknik analisis kualitatif dan kuantitatif. Elektroforesis mirip dengan teknik pemisahan lain seperti kromatografi, tetapi berbeda mengenai jenis sampel yang dianalisis, metode yang digunakan untuk pemisahan, prinsip yang digunakan, dll.
Definisi dan Prinsip Elektroforesis
Istilah Elektroforesis berarti Electro = medan listrik + Phoresis = migrasi. Jadi seperti namanya, “Elektroforesis adalah metode pemisahan di mana molekul bermuatan bermigrasi dalam kecepatan diferensial di medan listrik yang diterapkan.” Molekul bermuatan di bawah pengaruh medan listrik bermigrasi ke arah elektroda bermuatan berlawanan.
Molekul-molekul dengan muatan + ve bergerak menuju katoda dan -ve molekul bergerak ke arah Anoda. Migrasi ini disebabkan oleh muatan pada molekul dan potensi yang diterapkan di seluruh elektroda. Sampel yang diuji ditempatkan di salah satu ujung kertas di dekat salah satu elektroda. Ketika listrik diterapkan, molekul-molekul mulai bergerak ke masing-masing elektroda.
Namun pergerakannya dipengaruhi oleh berat molekul dari molekul tersebut. Jadi ketika campuran ditempatkan pada kertas elektroforesis atau agarosa, pita yang berbeda terlihat di sepanjang kertas setelah proses.
Hal ini disebabkan oleh laju diferensial dari pergerakan molekul berdasarkan beratnya. Molekul-molekul dengan berat molekul lebih tinggi bergerak lebih lambat. Sementara mereka yang berbobot kecil bergerak lebih cepat. Selain itu, ukuran molekul juga mempengaruhi pergerakan. Ukuran molekul yang lebih besar mengalami lebih banyak gesekan daripada yang lebih kecil dalam gerakan. Molekul-molekul ini bermigrasi dengan kecepatan dan panjang yang berbeda berdasarkan muatan, massa, dan bentuknya.
Jenis elektroforesis & tekniknya.
Elektroforesis secara luas dapat dibagi menjadi dua jenis
1. Elektroforesis lempengan
2. Elektroforesis kapiler.
Metode lempengan adalah metode klasik yang banyak digunakan untuk skala industri. prosesnya lambat, memakan waktu dan tebal. Namun, ini adalah satu-satunya metode yang tersedia untuk pemisahan protein seperti enzim, hormon, antibodi dan nukleotida seperti DNA dan RNA.
Elektroforesis lempeng ini selanjutnya dibagi menjadi tiga jenis berdasarkan prinsip yang digunakan untuk pemisahan.
a. Elektroforesis zona
b. Isoelectrofocusing
c. Immunoelectrophoresis:
Elektroforesis kertas adalah teknik yang menggunakan kertas saring Whatman No.1 yang dibasahi oleh buffer dan kemudian dihubungkan pada dua ujung ke dua elektroda yang bermuatan berlawanan.
Kemudian sampel diterapkan ke satu ujung dan membiarkan pemisahan komponen di bawah gradien listrik. Setelah pemisahan, kertas dikeringkan dan diwarnai untuk mendapatkan pita berwarna.
Pita berwarna ini diakui untuk sifat sampel dengan membandingkan dengan standar. Untuk sampel serum, lima pita protein dapat dipisahkan dengan kertas elektroforesis.
Pemisahan ini lebih efisien daripada jenis kertas karena laju berjalannya molekul lambat dan area pemisahannya lebih besar dengan ketebalan.
Sampel diterapkan dan mengalami medan listrik yang dapat menyebabkan pemisahan molekul. Molekul-molekul ini membentuk pita dan dapat dikenali dengan pewarnaan dan membandingkan dengan pita sampel standar.
Metode ini lebih efektif daripada kertas dan misalnya dari sampel serum, 15 pita protein dapat diisolasi.
b. Isoelectrofocusing:
Di sini pH isoelektrik diatur pada fokus yang berbeda dan karenanya molekul diimobilisasikan ke titik isoelektriknya. Mereka tidak bergerak menuju elektroda tetapi tetap pada pH isoelektrik tertentu. Ini bahkan lebih efisien untuk memisahkan protein, dan dari serum, 40 pita protein dapat dibentuk.
c. Immunoelectrophoresis:
Ini adalah metode dengan kombinasi prinsip-prinsip dari kedua elektroforesis dengan reaksi imun. Pertama, protein dipisahkan pada kertas elektroforesis. Kemudian antibodi dibiarkan menyebar melalui kertas dan bereaksi dengan molekul protein terpisah dalam pita.
Kedua metode ini sangat spesifik dan sangat sensitif serta banyak digunakan dalam mikrobiologi.
Elektroforesis kapiler:
Seperti namanya, di sini proses pemisahan terjadi di dalam tabung kapiler.
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis canggih. Ini dikembangkan dengan maksud untuk meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk pemisahan dan analisis dalam elektroforesis lempengan.
Elektroforesis kapiler ini membutuhkan sampel kecil dalam kisaran jika 0,1 hingga 10 μl sedangkan metode lempeng membutuhkan dalam μl. Juga, metode ini menghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi dan resolusi tinggi. Selain itu, komponen yang terpisah yang keluar dari salah satu ujung kapiler, segera dianalisis oleh detektor yang dipasang di ujung tabung.
Instrumentasi adalah sebagai berikut
Aplikasi elektroforesis:
1. Untuk memisahkan molekul kompleks: Banyak molekul biologis kompleks seperti vitamin B12. Antibiotik, protein dapat dipisahkan secara efisien dengan elektroforesis. Ini dimungkinkan karena perbedaan muatan di antara campuran.
2. Untuk analisis molekul asam nukleat seperti studi RNA dan DNA. Molekul rantai panjang ini dapat dianalisis hanya setelah pemisahan setelah elektroforesis. Ini membantu menentukan ukuran atau kerusakan pada molekul DNA atau RNA.